鼠抗人白細(xì)胞共同抗原單克隆抗體 Leukocyte Common Antigen （LCA） Western Blot技術(shù):

一、 原理

與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝#纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達。

二、分類鼠抗人白細(xì)胞共同抗原單克隆抗體 Leukocyte Common Antigen （LCA） 現(xiàn)常用的有底物化學(xué)發(fā)光ECL和底物DAB呈色，體同水平和實驗條件的是用*種方法，目前發(fā)表文章通常是用底物化學(xué)發(fā)光ECL。只要買現(xiàn)成的試劑盒就行，操作也比較簡單，原理如下（二抗用HRP標(biāo)記）：反應(yīng)底物為過氧化物+魯米諾，如遇到HRP，即發(fā)光，可使膠片曝光，就可洗出條帶。

三、 主要試劑

、 丙烯酰胺和N，N’-亞甲雙丙烯酰胺，應(yīng)以溫?zé)?/font>（以利于溶解雙丙稀酰胺）的去離子水配制含有29%（w/v）丙稀酰胺和%（w/v）N，N’-亞甲雙丙烯酰胺儲存液丙稀酰胺29g，N，N-亞甲叉雙丙稀酰胺g，加H2O至 00ml。）儲于棕色瓶，4℃避光保存。嚴(yán)格核實PH不得超過7.0，因可以發(fā)生脫氨基反應(yīng)是光催化或堿催化的。使用期不得超過兩個月，隔幾個月須重新配制。如有沉淀，可以過濾。 Leukocyte Common Antigen （LCA） 、 十二烷基硫#鈉SDS溶液:0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去離子水配制，室溫保存。

3、 分離膠緩沖液:.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和48mlmol/L HCl 混合，加水稀釋到00ml終體積。過濾后40℃保存。

4、 濃縮膠緩沖液:0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶于40mlH2O中，用約48ml mol/L HCl調(diào)至pH6.8加水稀釋到00ml終體積。過濾后40C保存。這兩種緩沖液必須使用Tris堿制備，再用HCL調(diào)節(jié)PH值，而不用 Tris.CL。

5、 TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化過硫#銨形成自由基而加速兩種丙稀酰胺的聚合。PH太低時，聚合反應(yīng)受到抑制。0%（w/v）過硫#胺溶液。提供兩種丙稀酰胺聚合所必須的自由基。去離子水配制數(shù)ml，臨用前配制.

6、 SDS- PAGE加樣緩沖液:pH6.8 0.5mol/L Tris緩沖液8ml，甘油6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰基乙醇3.2ml，0.05%溴酚藍.6ml，H2O 32ml混勻備用。按:或:2比例與蛋白質(zhì)樣品混合，在沸水終煮3min混勻后再上樣，一般為20-25ul，總蛋白量00μg。

7、 Tris-甘氨#電泳緩沖液:30.3gTris，88g甘氨#，0gSDS，用蒸餾水溶解至000ml，得0.25mol/L Tris-.92mol/L甘氨#電極緩沖液。臨用前稀釋0倍。

8、 轉(zhuǎn)移緩沖液：配制L轉(zhuǎn)移緩沖液，需稱取2.9g甘氨#、5.8gTris堿、0.37g SDS，并加入200ml甲醇，加水至總量L。

9、 麗春紅染液儲存液：麗春紅S 2g 三#乙#30g 磺基水楊# 30g 加水至00ml 用時上述儲存液稀釋0倍即成麗春紅S使用液。使用后應(yīng)予以廢棄。

SABC（小鼠/兔IgG）-POD濃縮型SABC試劑盒
LOP633 SABC（小鼠IgG）-CY3
LOP634 SABC（小鼠IgG）-FITC
LOP635 SABC（小鼠IgG）-POD
LOP636 SABC（小鼠IgG）-POD濃縮型SABC試劑盒
LOP637 SABC（小鼠IgM）-CY3
LOP638 SABC（小鼠IgM）-FITC
LOP639 SABC（小鼠IgM）-POD
LOP640 SABC-AP（大鼠IgG）
LOP64 SABC-AP（人IgG）
LOP642 SABC-AP（山羊IgG）
LOP643 SABC-AP（兔IgG）
LOP644 SABC-AP（小鼠/兔IgG）
LOP645 SABC-AP（小鼠IgG）
LOP646 SABC-AP（小鼠IgM）
LOP647 SABC—DS 980元/kit
LOP648 Western Blotting（大鼠IgG）
LOP649 Western Blotting（山羊IgG）
0、 脫脂奶粉5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊氮鈉（有毒，戴手套操作），溶于磷#緩沖鹽溶液（PBS）。

2、 Tris緩沖鹽溶液（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠抗人-MMP-9（6）鼠抗人-TIMP-。

4、 過氧化物酶標(biāo)記的第二抗體。

5、 NBT（溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶于00%二甲基甲酰胺，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L EDTA。